ストレプトアビジン シグマ CAS 9013-20-1

1.ストレプトアビジンについて知る
Streptomyces avidinii に由来する分泌タンパク質であるストレプトアビジン (SA) は、分子量が約 65-66 kDa、等電点が約 6.0 です。これは、4 つの相同サブユニットで構成される四量体タンパク質であり、それぞれが独立したビオチン結合部位を持っています。これは、ストレプトアビジン 1 分子が同時に 4 分子のビオチンに結合できることを意味します。両者間の解離定数 (Kd) は約 10 -15 M と低く、既知の非共有結合性生物学的相互作用の中で最も強力なものの 1 つであり、自然界で最も正確な「分子ロック機構」とみなすことができます。

卵白由来のアビジンと比較して、比類のない利点があります。

グリコシル化修飾を含まず、全体的に電気的に中性であるため、生理学的条件下での非特異的結合が極めて低く、実験のバックグラウンドがクリーンで、信号対雑音比が優れています。{{1}{2}さらに、変性やプロテアーゼ分解に対する優れた耐性、および極端な pH、高温 (70 ～ 80 ℃)、有機溶媒、従来の変性剤 (SDS や尿素など) に耐える能力により、アビジンに代わってビオチン結合システムにおける議論の余地のない「ゴールドスタンダード」となっています。

この優れた特性を活かして、ライフサイエンス、体外診断、薬剤スクリーニング、バイオセンシングなどの分野で威力を発揮します。

2. 免疫検査
免疫検出の分野でのアプリケーションは、最も古典的で広く使用されているアプリケーションです。 1970 年代後半に開発されて以来、ビオチン ストレプトアビジン システム (BAS) は、その超高親和性とカスケード増幅効果により、免疫標識および追跡分析の基礎となってきました。-統計によると、一般的な化学発光分析装置の約 85% が BAS ベースの検出方法を使用しており、BAS が主要な位置を占めていることがわかります。

2.1 酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA)

ELISA では、ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ (HRP) またはアルカリ ホスファターゼ (AP) を結合させることができ、ビオチン化抗体を介して酵素を標的に正確に導くことができます。 HRP は TMB、DAB、または ECL 発光基質を触媒して強力な化学シグナルまたは光学シグナルを生成します。一方、AP は BCIP/NBT、PNPP およびその他の基質を触媒して安定した色シグナルまたは化学発光シグナルを生成します。ビオチン化された標的分子は複数の標識ストレプトアビジンに結合することができ、マルチレベルのシグナル増幅を実現し、低存在量の標的の検出を可能にします。この技術はサンドイッチおよび競合 ELISA で広く使用されており、タンパク質の定量、抗体検出、病原体スクリーニングなどのシナリオをカバーしています。

2.2 タンパク質免疫ブロッティング (ウェスタンブロット)
ウェスタンブロットでは、ビオチン化二次抗体との結合により、転写フィルム上の標的タンパク質のシグナル強度が大幅に強化されます。従来の二次抗体システムと比較して、BAS システムはその 4 価の結合特性により、より強力なシグナル増幅を実現できます。さらに、ストレプトアビジンは非特異的結合が低いため、バックグラウンド干渉が大幅に減少し、特に少量のタンパク質の定量分析に適しています。

2.3 免疫組織化学 (IHC) および免疫細胞化学 (ICC)
HRP 標識または AP 標識ストレプトアビジンは、IHC および ICC に推奨されるシグナル増幅ツールです。 HRP システムは、非常に高い検出感度を必要とする実験に適していますが、AP システムは、HRP 阻害剤 (アジ化ナトリウムなど) を含むシステムや、長期間の発色と信号安定性を必要とする実験シナリオに特に適しています。-ビオチン化プローブまたは抗体をストレプトアビジン複合体に結合させることにより、標的分子を組織切片または細胞サンプル内で正確に位置特定できます。

2.4 免疫蛍光 (IF) および in situ ハイブリダイゼーション (ISH)

フルオレセイン標識ストレプトアビジン (FITC ストレプトアビジン、PE ストレプトアビジン、APC ストレプトアビジンなど) は、免疫蛍光染色および in situ ハイブリダイゼーションのための汎用視覚化ツールです。 FITC マーカーは、約 494/519 nm の励起/発光波長を持ち、明るい緑色の蛍光を示します。 PE マーカーの励起/発光波長は約 565/578 nm で、これはマルチカラー フローサイトメトリー分析の「ゴールド スタンダード」です。- APC マーカーは遠赤色スペクトルをカバーし、マルチカラー イメージングを容易にします。{6}}これらの蛍光マーカーはビオチン化抗体または核酸プローブに正確に結合し、標的分子の局在解析と定量的検出を実現します。

2.5 フローサイトメトリー (FACS)

フローサイトメトリーでは、ビオチン化抗体で標識された細胞表面抗原を検出するために、蛍光標識ストレプトアビジン (特に PE 標識) が使用されます。その優れた輝度により、非常に高い信号対雑音比が得られ、表面抗原の発現が低い細胞集団やシグナルが弱い細胞集団を効果的に検出できます。--これは、マルチカラー フローサイトメトリー分析に不可欠な試薬です。-

2.6 酵素結合イムノスポットアッセイ (ELISPOT)
AP 標識ストレプトアビジンは ELISPOT で優れたパフォーマンスを示し、固相分析や組織/細胞染色システムに適しています。{0}単一細胞レベルのサイトカイン分泌検出のための、数えられるスポットシグナルの基質生成を安定して触媒できます。-

3. タンパク質と核酸の精製
3.1 アフィニティークロマトグラフィーとタンパク質精製
ストレプトマイシンは、アフィニティークロマトグラフィー充填の中心成分です。精製するタンパク質をビオチン標識した後、ストレプトアビジン アガロースゲル (ストレプトアビジン アガロース/セファロースなど) と混合すると、標識されたタンパク質がフィラー上のストレプトアビジンに密接に結合します。洗浄して不純物を除去し、その後、適切な条件（沸騰 SDS-PAGE 緩衝液、0.1% SDS 処理、または pH 8.2 での 95% ホルムアミド+10 mM EDTA 処理など）で目的のタンパク質を洗浄することにより、高純度の生成物を得ることができます。-。

組換えヒトインスリンの工業生産を例にとると、高品質のストレプトアビジン磁気ビーズは 1 ミリグラムあたり 1200 pmol 以上の遊離ビオチンを結合でき、精製タンパク質の純度は 95% 以上に達します。{0}

3.2 免疫沈降 (IP) およびクロマチン免疫沈降 (ChIP)
免疫沈降におけるストレプトアビジン磁気ビーズの適用により、実験効率が大幅に向上します。研究者はビオチン化抗体をストレプトアビジン磁気ビーズに固定し、細胞溶解物と共インキュベートできます。

抗体は標的タンパク質とその相互作用タンパク質を特異的に捕捉し、「磁気ビーズ抗体標的タンパク質」複合体を形成します。簡単な操作と高感度で、外部磁場の作用下で迅速に分離できます。 ChIP 実験では、ビオチン化 DNA タンパク質複合体を捕捉し、タンパク質と DNA 間の相互作用を研究するためにストレプトアビジン磁気ビーズも使用されました。

3.3 プルダウン実験
タンパク質-の相互作用の研究では、磁気ビーズはビオチン化されたおとりタンパク質を捕捉し、それらと相互作用するプレタンパク質を「捕獲」できます。たとえば、腫瘍細胞の主要なシグナル伝達経路を研究する場合、P53 タンパク質を認識する特異的抗体をストレプトアビジン磁気ビーズに固定化し、腫瘍細胞溶解物と共インキュベートして、P53 およびその関連タンパク質を効果的に濃縮します。従来の免疫沈降法と比較して、磁気ビーズ IP は感度と特異性が高く、存在量の少ない標的タンパク質をより効果的に濃縮できます。

3.4 RNA プルダウン-
磁気ビーズは RNA プルダウン実験にも適しています。{0}}ストレプトアビジン磁気ビーズと結合した後、ビオチン化 RNA プローブは、RNA タンパク質相互作用ネットワークを研究するために細胞溶解物から RNA と相互作用するタンパク質を捕捉できます。
3.5 一本鎖 DNA の調製と核酸の抽出
ビオチン化オリゴヌクレオチドと結合して一本鎖 DNA を調製し、核酸を効率的に抽出することができ、分子クローニングや遺伝子工学において重要な役割を果たします。

4. ハイスループット検出と薬物スクリーニング
4.1. TR-FRET 検査プラットフォーム
ユウロピウムキレートなどの発光キレートと結合させて、TR-FRET（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）検出システムでのシグナル結合と分子捕捉を実行できます。-たとえば、THUNDER ™ は、TR- FRET 実験プラットフォーム用に特別に設計されたユウロピウム標識ストレプトアビジンで、さまざまなビオチン化修飾分子に安定して結合でき、タンパク質相互作用分析や標的薬物の予備スクリーニングに広く使用されています。

このシステムは均質で高スループットであるため、最新の医薬品開発の強力なツールとなっています。{0}

4.2 標的薬物送達
そのビオチン結合特性により、薬物標的送達システムにとって理想的なキャリアとなります。薬物分子をビオチンと結合させ、ストレプトアビジンの標的結合能力を利用することにより、正確な薬物送達が達成され、治療効率が向上し、副作用が軽減されます。

4.3 バイオセンサーとバイオチップ

バイオセンサーやバイオチップの製造の中核材料です。ストレプトアビジンを捕捉要素としてチップの表面に固定化することで、ビオチン標識タンパク質プローブまたは抗体をチップ上に固定化し、高スループットと高感度の検出を実現できます。-たとえば、心血管疾患のプロテインチップの初期スクリーニングでは、ストレプトアビジン磁気ビーズがチップ基板上に固定され、ビオチン化タンパク質プローブの結合に使用されます。これにより、疾患の初期段階や血液マーカー濃度が cTnI 0.01 ng/mL と低い場合でも、患者の異常を正確に検出でき、従来の診断方法と比較して診断ウィンドウが 2 ～ 3 時間短縮されます。

5. 細胞生物学とイメージング
5.1 細胞表面標識と蛍光細胞選別
蛍光標識ストレプトアビジン (Vari Fluor 488 Streptavidin など) は、細胞表面標識および蛍光細胞選別に広く使用されています。その発光スペクトルは可視光と近赤外光のスペクトル全体をカバーしており、多色標識実験では核や細胞質構造に容易に侵入し、イメージングや分析のために標的タンパク質を標識することができます。-

5.2 ナノテクノロジーと材料の自己組織化
その 4 価の結合特性により、ナノマテリアルの自己組織化にとって理想的な「架け橋」となります。-ビオチン ストレプトアビジンの標的結合を通じて、生物学的イメージングや環境モニタリングなどの学際的研究のためにさまざまなナノ構造を構築できます。

6. 抗ストレプトアビジン抗体
ストレプトアビジン ビオチン システムの普及に伴い、サンプル中の内因性抗ストレプトアビジン抗体 (ASA) が検出システムに干渉する可能性があるという、見落とされがちな問題が浮上しています。{0}。研究により、反応系における ASA と SA の結合は、特定の抗原抗体系の正しい構築に影響を及ぼし、その結果、結合、検出、または診断結果の精度が損なわれる可能性があることが判明しました。

この課題に対処するために、患者サンプル中の内因性 ASA を検出し、BAS システムとの干渉を回避するために使用できる抗ストレプトアビジン抗体検出キットが登場しました。 Roche Custom Biotech は、不活性ストレプトアビジン変異体 (ストレプトアビジン rec. inactive、poly) を開発しました。これは、ASA 干渉を特異的にブロックおよび排除するための追加手順なしで現在のシステムに追加でき、検出システムの精度と特異性が向上します。

7. ビオチン干渉
ストレプトアビジン ビオチン システムは強力ですが、ビオチン干渉というますます深刻な課題に直面しています。

試験サンプル中に高濃度の遊離ビオチンが存在すると、ストレプトアビジンの結合部位をめぐってビオチン化抗体と競合し、その結果、検出結果が歪められます。

100 mg のビオチンを経口投与すると、ピーク血漿濃度が 375 ～ 450 ng/mL に達する可能性があります。多発性硬化症の患者は、300 mg/日を経口摂取すると、血漿ビオチン レベルが 1000 ng/mL を超えることがあります。毎日 500 mg のビオチンを摂取すると、血中のビオチン濃度が非常に高くなる可能性があります。サンドイッチイムノアッセイでは、過剰なビオチンにより誤った低い結果が生じる可能性があります。競合イムノアッセイでは、誤った高い結果が得られる可能性があります。

多くの研究により、TSH、チロキシン PTH、副腎皮質刺激ホルモン、プロラクチン、テストステロン、コルチゾールなどの内分泌検査、さらには腫瘍マーカーや心臓機能マーカーがすべてビオチン干渉によってさまざまな程度の影響を受けることが示されています。 FDAは警告情報とそれに対応するガイドラインを相次いで発行している。対処戦略には、サンプルの段階希釈、液体クロマトグラフィー-質量分析などの非 BAS メソッドへの切り替え、ビオチン除去後の再検査（最短で 2 時間、最長で 15 日、場合によっては数か月）、または遊離ビオチン スカベンジャーの使用が含まれます。